Mely parvs alkalmas a trend kereskedésre, tudoc - 2010 kárpát-medencei doktoranduszok nemzetközi ...
A szervezet az elmúlt évtizedben a proteomika jelentıs modellszervezetévé vált. A több száz thermoplazmával foglalkozó publikáció ellenére teljes mértékében kereskedési opciók a semmiből az e szervezet genetikai manipulációjához elengedhetetlen eszközök, vektorok és transzformációs módszerek.
- Költözésben mostanra nagy tapasztalatom lett.
- Ingyenes ebooks bináris lehetőségek
- The part of the sequence drilled with coring can be subdivided into 4 lithological subunits which refer to four extremely thick Orbitolina assemblage zones: A Palorbitolina E.
- Szentkláray Jenő - A dunai hajóhadak története ()
- Az internetes keresetek nagyok
- NFGM utasítása a cafeteriajuttatásról A köztisztviselõk jogállásáról szóló
- (PDF) Empirikus kutatások az oktatásban és a pedagógusképzésben | Péter Tóth - pavaalkatresz.hu
A genetikai manipulációs rendszerekhez szükséges legalapvetıbb metodikák, mint például a mikroba szilárd táptalajon történı tenyésztése, sem megoldottak napjainkig. Munkánk elindítását két alapvetı eredmény inicializálta: ben japán kutatóknak sikerült egy novobiocin rezisztens T. Japán kutatók fedezték fel a T. PhD kutatási programom célja, a fenti nehézség ellenére, a hiányzó genetikai eszközrendszer fejlesztése volt a T. Mivel a szilárd táptalajon történı tenyésztés nélkülözhetetlen a további genetikai munkákhoz, ezért elıször a thermoplasma tenyészkörülményeihez megfelelı 58 o C, pH 1,5 szilika-alapú szilárd táptalajt fejlesztettünk.
URGON LIMESTONE OF INVERSE POSITION IN THE SE FORELAND OF THE VILLÁNY MTS, TRANSDANUBIA, HUNGARY
Ezzel párhuzamosan különbözı vektor-konstrukciókat építettünk a transzformációs kísérletekhez. Konstrukcióink rezisztencia modulja a novobiocin rezisztenciát mutató T. A rezisztencia fokozása érdekében helyspecifikus mutagenezissel módosítottuk a gyrB gént, majd ezzel a modullal a pNTA plazmidot alakítottuk ki. Egy új E. Számos transzformációs módszert tesztelünk, többek között elektroporációt, lipofekciót, magnetofekciót és a genegun technikát.
A módszerek önmagukban mind hatástalanok voltak, de speciális kombinációjukkal végül sikerült megismételhetı módon, rutinszerően transzformálni a T. Ezen módszer alkalmazásával ezidáig 14 novobiocin rezisztens T. A transzformánsok PCR alapú ellenırzésével igazoltuk a homológ rekombináció megtörténtét. További céljaink között elsı helyen szerepel az új transzformációs rendszer optimalizálása.
Uploaded by
Ezt követıen szeretnék a módszert mutáns génkonstrukciók létrehozására és bevitelre alkalmazni, ezáltal mód nyílna különbözı alegység-szervezıdéső enzimek struktúr- fehérjéinek in vivo fúziós proteinként történı expressziójára.
Egy KO-mutagenezis rendszer fejlesztésével pedig ismeretlen funkciójú T. Kulcsszavak: Thermoplasma acidophilum, transzformáció, novobiocin rezisztens girázB gén, homológ rekombináció A Thermoplasma acidophilum termoacidofil ısbaktérium Archaea; Euryarchaeota; Thermoplasmata; Thermoplasmatales; Thermoplasmataceae; Thermoplasma; Thermoplasma acidophilum optimális növekedéséhez 58 o C-ot és pH: 1,8 környezeti feltételeket igényel.
Elsı törzseit szénbányák felmelegedı meddıhányóiból izolálták a hatvanas években Darland et al. Ezt követıen a kilencvenes évek közepéig úgy gondolták, hogy kizárólag ebben a közegben élnek, de ben japán melegviző forrásokból is sikerült számos T.
A szervezet nem rendelkezik sejtfallal, csak egy háromrétegő, nm vastag membrán határolja, ami meglepı a mikroba különleges környezeti igényei tükrében. A sejtek lényeges tulajdonsága, hogy semleges pH-n azonnali és teljes lízis következik be, ami jelentısen megkönnyíti a DNS és fehérje izolálást.
Eddigi kísérletekben a mikrobát csak élesztıkivonat tartalmú táptalajon sikerült tenyészteni, ezen viszont mind aerob és anaerob környezetben is jól szaporodik anaerob környezetben elemi ként használ terminális elektron akceptorként. Egészen a ben befejezett genom projektig úgy tekintettek a termoplasmákra mint az eukarióta sejt lehetséges ısére Ruepp et al. Annak ellenére, hogy a genom projekt a rokonságot megcáfolta, a T. Annak ellenére, hogy a T. Sikeres transzformációs rendszerek kialakításának négy feltétele van.
A szilárd táptalajon való tenyésztés azért az egyik legfontosabb elem, mert ezzel a módszerrel lehet rutinszerő klonális munkát végezni. A Robert Koch által az as években kidolgozott szilárd táptalajon történı tenyésztés vezetett a tiszta tenyészetek, genetikailag homológ sejtvonalak kialakításához- azaz a modern mikrobiológia kialakításához.
Számos ısbaktérium - többek között az általunk vizsgált T. Így azokból csak nagyon fáradságos munkával, az ún. Hasonlóan fontos feltétel a vadtípusú és genetikailag manipulált sejtek elkülönítése. Erre a feladatra a legkülönbözıbb szelekciós ágensek használatosak, melyek közül legelterjedtebbek, egyszerő alkalmazhatóságuk miatt, az antibiotikumok.
Much more than documents.
Sok antibiotikum az ısbaktériumok esetben hatástalan az extrém környezeti feltételek, vagy az ısbaktériumok fiziológiai-szerkezeti adottságai miatt. Végül szükség van egy hatékony transzformációs módszerre, mely segítségével bejuttatjuk a genetikai információt hordozó DNS molekulát a célszervezetbe. Számos esetben a baktériumok transzformálására rutinszerően használt módszerek, mint pl. Ezen alapvetı elıfeltételek számos ısbaktérium esetében nem megoldottak, mint például: Picrophilus torridus, Methanosarcina thermophila, Pyrolobus fumarii, Thermoplasma volcanium, Thermoplasma acidophilum Allers et al.
E dolgozat a T. A kísérletek elindítását két elızetes eredmény motiválta: ben japán kutatók azonosították a novobiocin rezisztenciáért felelıs módosult girázB gyrB gént egy általuk izolált novobiocin rezisztens T.
A szervezet szaporodását minden esetben a táptalaj turbiditásnak mérésével O. Kísérleteinkben kétféle szilárd táptalaj alkalmazásának a lehetıségét vizsgáltuk: a már korábban leírt gelrite-bázisú Yasuda et al. A pSTA bifunkciónális shuttle vektor és a pDTA integrációs vektor megépítése Elsıként egy bifunkciónális shuttle vektort építettünk pSTAmelynek alapjául a pRSF-Duett vektort választottuk, melynek NcoI klonozó helyére azt a pTA1 vektorból származó NcoI enzimmel hasított ~ bp nagyságú fragmentet illesztettük be, mely három 7 nyitott leolvasási keretet ORF, open reading frame és egy ori régiót kódolt.
Az így elkészült vektort XbaI és HpaI restrikciós endonukleáz enzimekkel emésztettük, majd gélbıl visszaizoláltuk Qiagen Gel Extratcion Kit a megfelelı fragmentet. Ezzel párhuzamosan mennyit kereshet valójában a bitcoinokon már korábban elkészített pCH2-es vektort XbaI és ZraI enzimekkel emésztettük, és agaróz gélbıl visszaizoláltuk a novobiocin rezisztenciáért felelıs girázB gyrB gént tartalmazó DNS darabot.
A pCH2-es vektort egy másik kísérlet sorozathoz terveztük, alapját egy pUCas vektor képezi, melybe a novobiocin rezisztenciáért felelıs girázB gyrB gént bináris opciók stratégiai alapelvei a Taes promotert klónoztuk az ZraI-XbaI klónozó helyekre.
Ezt követıen a vektort és az inszertet ligáltuk, majd E. Az klónozó munkánk során általános laboratóriumi módszereket használtunk Sambrook et al. Ezzel egy idıben, homológ rekombinációs célokra egy integratív vektort készítettünk, melynek alapja a pUCas vektor volt, melynek NdeI-EcoRI klónozó helyeire a novobiocin rezisztenciáért felelıs T. Irodalmi adatok alapján tudjuk, hogy a novobiocin rezisztencia jelentısen megnövelhetı akár egyetlen aminosav cseréjével is.
Mi a pDTA vektoron a os mely parvs alkalmas a trend kereskedésre levı arginint helyspecifikus mutagenezissel hisztidinre cseréltük létrehozva a pNTA plazmidot, mivel egy novobiocin rezisztens Staphylococcus saprophyticus gyrB mutáns esetében ez bizonyult a kritikus aminosav cserének Vickers et al. Transzformációs módszer fejlesztése Kísérleteinkben mely parvs alkalmas a trend kereskedésre transzformációs módszert teszteltünk a T. Elıször az elektroporáció használatának lehetıségét teszteltük, mely során nagy fesztültséggel kíséreltünk meg plazmidokat bejuttatni a sejtekbe.
Emellett néhány a mikroorganizmusok körében kevésbé vagy egyáltalán nem elterjedt módszert próbáltunk ki.
Úgy mint gén puskát vagy gén ágyút, amit fıként növényi sejtek és szövetek transzformációjára alkalmaznak Shark et al. A DNS-sel bevont különbözı átmérıjő nm, nm aranyszemcséket kíséreltük meg belıni a sejtekbe.
A kísérleteteket a gödöllıi Mezıgazdasági Biotechnológiai Intézetben végeztük az általuk kifejlesztett protokoll alapján.
Ezt követıen lipofekció és magnetofekció módszereket teszteltük. A tolerancia vizsgálat minden esetben 10 napig tartott és 12 óránként mintát vettünk a tenyészetbıl és megmértük az OD értéket.
A vad típusú törzset minden esetben negatív kontrollként alkalmaztuk. Egy másik kísérletben ezek a preparátumok egy girázB gyrB specifikus PCR reakció templátjaként szolgáltak.
Ezzel párhuzamosan az E. A restrikciós emésztést a gyártó által megadott protokoll szerint állítottuk össze New England BioLab Inc. Ezt követıen agaróz-gélelektroforézissel detektáltuk az eredményeket. A bevezetésben leírt munkánk célja az volt, hogy kifejlesszük a T. Elıször a rendelkezésünkre álló információk alapján egy olyan szilárd táptalaj fejlesztését kezdtük el, melyen a T.
Erre a célra egy gelrite-bázisú szilárd médiumot készítettünk Yasuda Yasuda et al. Ezekkel a változtatásokkal elértük, hogy nap alatt 0,5 mm átmérıjő telepek fejlıdjenek. Ezzel párhuzamosan szilika-bázisú médiumot fejlesztettünk ki a már leírt módon, melyen az inkubáció 7.
Thermoplasma acidophilum colonies on silica-based medium after 7 mely parvs alkalmas a trend kereskedésre of incubation A következı mely parvs alkalmas a trend kereskedésre a sikeres transzformációhoz szükséges vektor-konstrukciók megalkotása volt. Elıször a pSTA jelő shuttle vektort hoztuk létre, mely önállóan képes fennmaradni E. E vektor 3 fı részbıl áll: a bp nagyságú pTA1 vektorból származó, három nyitott leolvasási keret ORF, open reading frame régiót és egy ori régiót tartalmazó Thermoplasma specifikus rész, a T.
A pSTA vektor restrikciós hasítási térképét a 2.
tudoc - 2010 kárpát-medencei doktoranduszok nemzetközi ...
Abból a célból, hogy további munkák elkezdéséhez meggyızıdjünk arról, hogy T. Ennek alapja a pUCas E. A vektor nem tartalmaz T. Az integratív vektor sematikus térképét a 3. A pDTA vektoron egy további helyspecifikus mutagenezissel kicseréltük a os pozicióban levı arginint hisztidinre. Mindkét vektortípust a felhasználás elıtt szekvenálással ellenıriztük. Jelmagyarázat: a fekete nyílak az E.
Figure 2. Map of pSTA shuttle vector Relevant restriction sites are shown. Black arrows indicate the position of the E. Jelmagyarázat: a fekete nyíl az E. Figure 3. Map of pDTA integrative vector. Relevant restriction sites are shown.
The black arrow indicates the E. The blue arrow corresponds to Thermoplasma protein genes — Ta, Ta and Ta Az általunk tesztelt módszerek önmagukban nem voltak hatékonyak, viszont speciális kombinációjukkal sikerült megismételhetı módon, rutinszerően transzformálni a T. Ez idáig 14 novobiocin rezisztens T. A transzformánsokat elıször novobiocin rezisztencia teszteknek vetettük alá folyékony médiumban.
A vad típusú T. A legmagasabb novobiocin toleranciával rendelkezı sejtvonal a pNTA plazmidot hordozó volt, ezen a plazmidon végeztük el a helyspecifikus mutagenezist, a os pozícióban levı arginint-hisztidin cserét. A pNTA plazmiddal transzformált T. Effect of novobiocin on growth of Thermoplasma acidophilum strains A tenyésztéses vizsgálatokkal párhuzamosan molekuláris biológiai módszerekkel is igazoltuk T.