Mely parvs alkalmas a trend kereskedésre, tudoc - 2010 kárpát-medencei doktoranduszok nemzetközi ...


A szervezet az elmúlt évtizedben a proteomika jelentıs modellszervezetévé vált. A több száz thermoplazmával foglalkozó publikáció ellenére teljes mértékében kereskedési opciók a semmiből az e szervezet genetikai manipulációjához elengedhetetlen eszközök, vektorok és transzformációs módszerek.

  1. Költözésben mostanra nagy tapasztalatom lett.
  2. Ingyenes ebooks bináris lehetőségek
  3. The part of the sequence drilled with coring can be subdivided into 4 lithological subunits which refer to four extremely thick Orbitolina assemblage zones: A Palorbitolina E.
  4. Szentkláray Jenő - A dunai hajóhadak története ()
  5. Az internetes keresetek nagyok
  6. NFGM utasítása a cafeteriajuttatásról A köztisztviselõk jogállásáról szóló
  7. (PDF) Empirikus kutatások az oktatásban és a pedagógusképzésben | Péter Tóth - pavaalkatresz.hu

A genetikai manipulációs rendszerekhez szükséges legalapvetıbb metodikák, mint például a mikroba szilárd táptalajon történı tenyésztése, sem megoldottak napjainkig. Munkánk elindítását két alapvetı eredmény inicializálta: ben japán kutatóknak sikerült egy novobiocin rezisztens T. Japán kutatók fedezték fel a T. PhD kutatási programom célja, a fenti nehézség ellenére, a hiányzó genetikai eszközrendszer fejlesztése volt a T. Mivel a szilárd táptalajon történı tenyésztés nélkülözhetetlen a további genetikai munkákhoz, ezért elıször a thermoplasma tenyészkörülményeihez megfelelı 58 o C, pH 1,5 szilika-alapú szilárd táptalajt fejlesztettünk.

URGON LIMESTONE OF INVERSE POSITION IN THE SE FORELAND OF THE VILLÁNY MTS, TRANSDANUBIA, HUNGARY

Ezzel párhuzamosan különbözı vektor-konstrukciókat építettünk a transzformációs kísérletekhez. Konstrukcióink rezisztencia modulja a novobiocin rezisztenciát mutató T. A rezisztencia fokozása érdekében helyspecifikus mutagenezissel módosítottuk a gyrB gént, majd ezzel a modullal a pNTA plazmidot alakítottuk ki. Egy új E. Számos transzformációs módszert tesztelünk, többek között elektroporációt, lipofekciót, magnetofekciót és a genegun technikát.

mely parvs alkalmas a trend kereskedésre

A módszerek önmagukban mind hatástalanok voltak, de speciális kombinációjukkal végül sikerült megismételhetı módon, rutinszerően transzformálni a T. Ezen módszer alkalmazásával ezidáig 14 novobiocin rezisztens T. A transzformánsok PCR alapú ellenırzésével igazoltuk a homológ rekombináció megtörténtét. További céljaink között elsı helyen szerepel az új transzformációs rendszer optimalizálása.

Uploaded by

Ezt követıen szeretnék a módszert mutáns génkonstrukciók létrehozására és bevitelre alkalmazni, ezáltal mód nyílna különbözı alegység-szervezıdéső enzimek struktúr- fehérjéinek in vivo fúziós proteinként történı expressziójára.

Egy KO-mutagenezis rendszer fejlesztésével pedig ismeretlen funkciójú T. Kulcsszavak: Thermoplasma acidophilum, transzformáció, novobiocin rezisztens girázB gén, homológ rekombináció A Thermoplasma acidophilum termoacidofil ısbaktérium Archaea; Euryarchaeota; Thermoplasmata; Thermoplasmatales; Thermoplasmataceae; Thermoplasma; Thermoplasma acidophilum optimális növekedéséhez 58 o C-ot és pH: 1,8 környezeti feltételeket igényel.

Elsı törzseit szénbányák felmelegedı meddıhányóiból izolálták a hatvanas években Darland et al. Ezt követıen a kilencvenes évek közepéig úgy gondolták, hogy kizárólag ebben a közegben élnek, de ben japán melegviző forrásokból is sikerült számos T.

A szervezet nem rendelkezik sejtfallal, csak egy háromrétegő, nm vastag membrán határolja, ami meglepı a mikroba különleges környezeti igényei tükrében. A sejtek lényeges tulajdonsága, hogy semleges pH-n azonnali és teljes lízis következik be, ami jelentısen megkönnyíti a DNS és fehérje izolálást.

Eddigi kísérletekben a mikrobát csak élesztıkivonat tartalmú táptalajon sikerült tenyészteni, ezen viszont mind aerob és anaerob környezetben is jól szaporodik anaerob környezetben elemi ként használ terminális elektron akceptorként. Egészen a ben befejezett genom projektig úgy tekintettek a termoplasmákra mint az eukarióta sejt lehetséges ısére Ruepp et al. Annak ellenére, hogy a genom projekt a rokonságot megcáfolta, a T. Annak ellenére, hogy a T. Sikeres transzformációs rendszerek kialakításának négy feltétele van.

A szilárd táptalajon való tenyésztés azért az egyik legfontosabb elem, mert ezzel a módszerrel lehet rutinszerő klonális munkát végezni. A Robert Koch által az as években kidolgozott szilárd táptalajon történı tenyésztés vezetett a tiszta tenyészetek, genetikailag homológ sejtvonalak kialakításához- azaz a modern mikrobiológia kialakításához.

Számos ısbaktérium - többek között az általunk vizsgált T. Így azokból csak nagyon fáradságos munkával, az ún. Hasonlóan fontos feltétel a vadtípusú és genetikailag manipulált sejtek elkülönítése. Erre a feladatra a legkülönbözıbb szelekciós ágensek használatosak, melyek közül legelterjedtebbek, egyszerő alkalmazhatóságuk miatt, az antibiotikumok.

Much more than documents.

Sok antibiotikum az ısbaktériumok esetben hatástalan az extrém környezeti feltételek, vagy az ısbaktériumok fiziológiai-szerkezeti adottságai miatt. Végül szükség van egy hatékony transzformációs módszerre, mely segítségével bejuttatjuk a genetikai információt hordozó DNS molekulát a célszervezetbe. Számos esetben a baktériumok transzformálására rutinszerően használt módszerek, mint pl. Ezen alapvetı elıfeltételek számos ısbaktérium esetében nem megoldottak, mint például: Picrophilus torridus, Methanosarcina thermophila, Pyrolobus fumarii, Thermoplasma volcanium, Thermoplasma acidophilum Allers et al.

E dolgozat a T. A kísérletek elindítását két elızetes eredmény motiválta: ben japán kutatók azonosították a novobiocin rezisztenciáért felelıs módosult girázB gyrB gént egy általuk izolált novobiocin rezisztens T.

A szervezet szaporodását minden esetben a táptalaj turbiditásnak mérésével O. Kísérleteinkben kétféle szilárd táptalaj alkalmazásának a lehetıségét vizsgáltuk: a már korábban leírt gelrite-bázisú Yasuda et al. A pSTA bifunkciónális shuttle vektor és a pDTA integrációs vektor megépítése Elsıként egy bifunkciónális shuttle vektort építettünk pSTAmelynek alapjául a pRSF-Duett vektort választottuk, melynek NcoI klonozó helyére azt a pTA1 vektorból származó NcoI enzimmel hasított ~ bp nagyságú fragmentet illesztettük be, mely három 7 nyitott leolvasási keretet ORF, open reading frame és egy ori régiót kódolt.

Az így elkészült vektort XbaI és HpaI restrikciós endonukleáz enzimekkel emésztettük, majd gélbıl visszaizoláltuk Qiagen Gel Extratcion Kit a megfelelı fragmentet. Ezzel párhuzamosan mennyit kereshet valójában a bitcoinokon már korábban elkészített pCH2-es vektort XbaI és ZraI enzimekkel emésztettük, és agaróz gélbıl visszaizoláltuk a novobiocin rezisztenciáért felelıs girázB gyrB gént tartalmazó DNS darabot.

A pCH2-es vektort egy másik kísérlet sorozathoz terveztük, alapját egy pUCas vektor képezi, melybe a novobiocin rezisztenciáért felelıs girázB gyrB gént bináris opciók stratégiai alapelvei a Taes promotert klónoztuk az ZraI-XbaI klónozó helyekre.

Ezt követıen a vektort és az inszertet ligáltuk, majd E. Az klónozó munkánk során általános laboratóriumi módszereket használtunk Sambrook et al. Ezzel egy idıben, homológ rekombinációs célokra egy integratív vektort készítettünk, melynek alapja a pUCas vektor volt, melynek NdeI-EcoRI klónozó helyeire a novobiocin rezisztenciáért felelıs T. Irodalmi adatok alapján tudjuk, hogy a novobiocin rezisztencia jelentısen megnövelhetı akár egyetlen aminosav cseréjével is.

Mi a pDTA vektoron a os mely parvs alkalmas a trend kereskedésre levı arginint helyspecifikus mutagenezissel hisztidinre cseréltük létrehozva a pNTA plazmidot, mivel egy novobiocin rezisztens Staphylococcus saprophyticus gyrB mutáns esetében ez bizonyult a kritikus aminosav cserének Vickers et al. Transzformációs módszer fejlesztése Kísérleteinkben mely parvs alkalmas a trend kereskedésre transzformációs módszert teszteltünk a T. Elıször az elektroporáció használatának lehetıségét teszteltük, mely során nagy fesztültséggel kíséreltünk meg plazmidokat bejuttatni a sejtekbe.

Emellett néhány a mikroorganizmusok körében kevésbé vagy egyáltalán nem elterjedt módszert próbáltunk ki.

Úgy mint gén puskát vagy gén ágyút, amit fıként növényi sejtek és szövetek transzformációjára alkalmaznak Shark et al. A DNS-sel bevont különbözı átmérıjő nm, nm aranyszemcséket kíséreltük meg belıni a sejtekbe.

mely parvs alkalmas a trend kereskedésre

A kísérleteteket a gödöllıi Mezıgazdasági Biotechnológiai Intézetben végeztük az általuk kifejlesztett protokoll alapján.

Ezt követıen lipofekció és magnetofekció módszereket teszteltük. A tolerancia vizsgálat minden esetben 10 napig tartott és 12 óránként mintát vettünk a tenyészetbıl és megmértük az OD értéket.

mely parvs alkalmas a trend kereskedésre

A vad típusú törzset minden esetben negatív kontrollként alkalmaztuk. Egy másik kísérletben ezek a preparátumok egy girázB gyrB specifikus PCR reakció templátjaként szolgáltak.

Ezzel párhuzamosan az E. A restrikciós emésztést a gyártó által megadott protokoll szerint állítottuk össze New England BioLab Inc. Ezt követıen agaróz-gélelektroforézissel detektáltuk az eredményeket. A bevezetésben leírt munkánk célja az volt, hogy kifejlesszük a T. Elıször a rendelkezésünkre álló információk alapján egy olyan szilárd táptalaj fejlesztését kezdtük el, melyen a T.

Erre a célra egy gelrite-bázisú szilárd médiumot készítettünk Yasuda Yasuda et al. Ezekkel a változtatásokkal elértük, hogy nap alatt 0,5 mm átmérıjő telepek fejlıdjenek. Ezzel párhuzamosan szilika-bázisú médiumot fejlesztettünk ki a már leírt módon, melyen az inkubáció 7.

Thermoplasma acidophilum colonies on silica-based medium after 7 mely parvs alkalmas a trend kereskedésre of incubation A következı mely parvs alkalmas a trend kereskedésre a sikeres transzformációhoz szükséges vektor-konstrukciók megalkotása volt. Elıször a pSTA jelő shuttle vektort hoztuk létre, mely önállóan képes fennmaradni E. E vektor 3 fı részbıl áll: a bp nagyságú pTA1 vektorból származó, három nyitott leolvasási keret ORF, open reading frame régiót és egy ori régiót tartalmazó Thermoplasma specifikus rész, a T.

A pSTA vektor restrikciós hasítási térképét a 2.

tudoc - 2010 kárpát-medencei doktoranduszok nemzetközi ...

Abból a célból, hogy további munkák elkezdéséhez meggyızıdjünk arról, hogy T. Ennek alapja a pUCas E. A vektor nem tartalmaz T. Az integratív vektor sematikus térképét a 3. A pDTA vektoron egy további helyspecifikus mutagenezissel kicseréltük a os pozicióban levı arginint hisztidinre. Mindkét vektortípust a felhasználás elıtt szekvenálással ellenıriztük. Jelmagyarázat: a fekete nyílak az E.

Figure 2. Map of pSTA shuttle vector Relevant restriction sites are shown. Black arrows indicate the position of the E. Jelmagyarázat: a fekete nyíl az E. Figure 3. Map of pDTA integrative vector. Relevant restriction sites are shown.

The black arrow indicates the E. The blue arrow corresponds to Thermoplasma protein genes — Ta, Ta and Ta Az általunk tesztelt módszerek önmagukban nem voltak hatékonyak, viszont speciális kombinációjukkal sikerült megismételhetı módon, rutinszerően transzformálni a T. Ez idáig 14 novobiocin rezisztens T. A transzformánsokat elıször novobiocin rezisztencia teszteknek vetettük alá folyékony médiumban.

A vad típusú T. A legmagasabb novobiocin toleranciával rendelkezı sejtvonal a pNTA plazmidot hordozó volt, ezen a plazmidon végeztük el a helyspecifikus mutagenezist, a os pozícióban levı arginint-hisztidin cserét. A pNTA plazmiddal transzformált T. Effect of novobiocin on growth of Thermoplasma acidophilum strains A tenyésztéses vizsgálatokkal párhuzamosan molekuláris biológiai módszerekkel is igazoltuk T.